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技術(shù)文章

默克生命科學(xué) | DNA和蛋白質(zhì)去磷酸化操作流程

更新時間:2024-01-05 瀏覽次數(shù):834

去磷酸化指的是水解去除磷酸(PO43?)基團(tuán)的過程。在對蛋白質(zhì)或DNA去磷酸化時,需要使用酶或水解酶切割酯鍵。例如,磷酸酶可將磷酸單酯水解為磷酸根離子和帶有游離羥基(OH)基團(tuán)的分子,從而去除磷酸基團(tuán)。 默提供各類生命科學(xué)解決方案和服務(wù)


1.利用小牛腸堿性磷酸酶對DNA進(jìn)行去磷酸化

材料

牛小腸堿性磷酸酶(貨號 P4978)
10X CIP緩沖液(貨號C3225)
1 M NaCl
0.5 M Tris-HCl,25 °C下pH 7.9
0.1 M MgCl2
0.01 M 二硫蘇糖醇

存儲緩沖液

10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl2
0.1 mM ZnCl2
50%甘油

操作流程

  1. 1X CIP緩沖液溶解DNA(0.5 µg DNA/10 µL)。

  2. 對于5’突出的粘末端DNA加入0.1單位/皮摩爾的CIP;對于3'突出的粘末端或布路姆試劑加入1單位/皮摩爾。

  3. 在37℃孵育60分鐘。

  4. 苯酚/氯仿2(貨號P3803 或P2069)提取或凝膠純化DNA。*

  5. 乙醇沉淀法恢復(fù)DNA。2

*注意:苯酚提取或凝膠純化后無需再熱滅活。

熱滅活:對于牛腸酶,在5毫摩爾/升的乙二胺四乙酸下,加熱至75℃10分鐘,可使95%以上的活性失活。 注意:大腸桿菌的堿性磷酸酶比牛腸酶在高溫下更穩(wěn)定,也更耐熱滅活。


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